發(fā)布時間：2021/6/3 8:34:28 閱讀次數(shù)：1274
酶聯(lián)免疫吸附測定enzyme linked immunosorbent assay（簡寫ELISA）,指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法.要知道elisa操作步驟首先我們先了解一下elisa的原理是什么.
elisa的原理：
①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性.
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性, 又保留酶的活性.在測定時,把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng).用洗滌的方法使固相載體 上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,*后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例.加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物, 產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)焰色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析.由于酶的催化效率很高,故可地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達(dá)到 很高的敏感度.
elisa操作步驟：
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml.在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃過夜.次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘.（簡稱洗滌,下同）.
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時.然后洗滌.（同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔）.
3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml.37℃孵育0.5～1小時,洗滌.
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10～30分鐘.
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml.
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越 強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+” “-”號表示.也可測O·D值：在ELISA檢測儀上,于450nm（若以ABTS顯色,則 410nm）處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性.
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜.次日 洗滌3次.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌.（同時做空白 陰性及陽性孔對照）于反應(yīng)孔 中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗體（抗抗體）0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,*后一遍用DDW洗滌.其余步驟同“雙抗體
以上是elisa操作步驟,那么在elisa操作步驟的操作步驟中需要注意什么呢？下面是elisa實(shí)驗的注意事項：
1.正式試驗時,應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性.有時本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清 兔血清或BSA等封閉.
2.在elisa操作步驟中,進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的,其中包括：固相載體的選擇 包被抗體（或抗原）的選擇 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇 酶的底物及供氫體的選擇
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